禽流感高免卵黃抗體的研究

更新時間:17/01/17 12:48:01     來源:www.loccomama.com關閉分    享:
禽流感是由流感病毒引起的一種烈性傳染病,對養禽業構成了嚴重的威脅。將禽流感病毒油乳劑滅活苗按一定的免疫程序給SPF蛋雞強化免疫,製備抗禽流感的高免卵黃液,用於治療禽流感取得了一定的效果。但粗製卵黃液中含有大量脂類及其他的雜蛋白,用於治療時存在注射困難,吸收不良,過敏反應,保存期短和運輸不便”。因此,AG亚游集团對禽流感高免卵黃抗體進行了純化研究。
1 材料與方法
1.1 疫苗 禽流感油乳劑滅活苗,中牧股份實業有限公司鄭州生藥廠,批號030444。
1.2 禽流感抗原 山西省獸醫防治站提供。
1.3試驗用動物 購自山東省家禽研究所的200日齡SPF產蛋雞和20日齡SPF小雞、太穀縣某養雞場200日齡非免疫產蛋雞30隻及健康小鼠10隻。
1.4 免疫方法 SPF產蛋雞肌注禽流感油乳劑滅活苗1mL,首免後7~10d再次用該苗2mL進行二免,二免後每隔3d用HI測定其卵黃效價,當卵黃效價達2E10以上即可收集雞蛋,用於製備卵黃液。以後每隔一定時間強化免疫1次,保證卵黃效價。
1.5 卵黃液的製備 選擇卵黃效價達2E10以上的高免蛋,分離蛋黃與滅菌蒸餾水按1∶1稀釋,充分攪拌,保存備用。
1.6 1gY的純化 製備好的卵黃液中加入相當與原卵黃體積8倍、4℃預冷的酸性蒸餾水,邊加邊攪拌,4℃保溫靜置過夜,取上清液,上清液用濾布過濾,過濾液進行超濾濃縮,濃縮倍數為4,所得超濾液中加入硫柳汞至終濃度為0.01%,用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,即為精製禽流感高免卵黃抗體。
1.7 抗體效價檢測采用血凝抑製試驗。
1.8 無菌檢驗 2.0mL精製禽流感高免卵黃抗體分別接種普通瓊脂培養基、血液瓊脂斜麵和厭氧肉湯中,37℃培養48h,觀察有無細菌生長。
1.9 安全試驗 健康小鼠10隻,每隻皮下注射本品1mL;20日齡SPF小雞10隻,每隻皮下注射本品5mL,觀察2周。
1.10 動物試驗 取200日齡非免疫產蛋雞30隻,隨機分為3組,第1組為健康對照組,不注射任何藥物,隔離飼養。第2和第3組每隻雞肌注、點眼、滴鼻接種EID50AIV種毒0.2mL。攻毒後24h分別給第2組雞皮下注射本品2.0mL,第3組皮下注射生理鹽水2.0mL。觀察10d,記錄每組雞發病、死亡情況。
1.11 脫脂率與蛋白質回收率的測定用紫外分光光度計測定精製禽流感高免卵黃抗體在A280和A260處的吸光度,按紫外吸收差法測定蛋白質的含量,計算公式:蛋白質濃度(mg/mL)=(1.45×A280-0.74×A260)。脂肪含量測定采用香草醛顯色法。
1.12 保存期試驗 將精製禽流感高免卵黃抗體分別保存在室溫4℃和~20℃,每月測定一次HI效價。
2 結果
2.1 物理性狀 應為無色或淡黃色液體,放置一段時間後瓶底有少量沉澱,pH值呈中性。
2.2 無菌檢驗 2.0mL精製禽流感高免卵黃抗體分別接種普通瓊脂培養基、血液瓊脂斜麵和厭氧肉湯中,37~12培養48h,未見有任何細菌生長。
2.3 安全試驗 健康小鼠10隻,每隻皮下注射本品2mL;20日齡SPF小雞10隻,每隻皮下注射本品5mL,觀察2周,未發現任何異常,精神狀態和生長情況良好,證明精製禽流感高免卵黃抗體是安全可靠的。
2.4 動物試驗 第1組健康狀況良好,無發病死亡。第3組在攻毒後24~48h開始發病,出現死亡,72h全部發病,7d內死亡8隻。第2組在注射精製禽流感高免卵黃抗體後12h即攻毒後36h有4隻雞發病,發病後12~24h,其中1隻死亡,其餘3隻均恢複正常。證明該卵黃抗體確實起到了中和病毒的作用。
2.5 脫脂率與蛋白質含量 沉澱中的脂肪經香草醛顯色法測定含量為95.7%,精製卵黃抗體中蛋白質含量經紫外吸收差法測定為9.47mg/mL,該純化卵黃抗體的方法去脂效果好,IgY回收率比較高。
2.6 保存期試驗 精製禽流感高免卵黃抗體室溫條件下可保存10個月,4~12條件下保存15個月,-20℃條件下保存18個月。
3 小結與討論
3.1 禽流感是Ⅰ類烈性傳染病,一旦發病,將對養雞業造成嚴重的威脅,用禽流感油苗免疫蛋雞製備高免卵黃液,給發病雞注射,隨著抗體的擴散直接中和體內的病毒,使雞體在短時間內獲得迅速保護,發揮了緊急預防和緊急治療的作用。精製禽流感高免卵黃抗體對200日齡非免疫產蛋雞及20日齡SPF小雞安全可靠,有較好的保護作用,在生產實踐中可以推廣應用。
3.2 卵黃液中含有大量的脂類和雜蛋白,對IgY的吸收造成影響,經過純化去掉了脂類和雜蛋白,純化後的IgY不但易於注射,而且易於吸收,治療效果好。該純化過程采用水稀釋法,在此基礎上加以改進,與PEG沉澱法、氯仿抽提法、硫酸鈉沉澱法等純化方法比較,水稀釋法成本低,易於操作,實驗條件簡單,適合工業化生產。
3.3 現已報道有治療新城疫、法氏囊、禽腦脊髓炎的各種卵黃液,用於治療相應的疾病,取得了較好的治療效果。但禽流感亞型眾多,變異性極強,所以應進行本地毒株分離,製備油苗免疫,這樣製備的卵黃抗體更有針對性,預防和治療的效果會更好。
3.4 製備卵黃抗體的蛋主要來自普通的產蛋雞,這樣就會造成一些疾病的垂直傳播,可以采用非免疫雞群,排除一些蛋傳疾病,也可將製備好的卵黃抗體進行60Coγ射線輻射滅菌,同樣可以達到滅菌的目的。
3.5 由於除去了大部分的脂類,精製禽流感高免卵黃抗體的保存期比普通卵黃抗體的保存期延長,給卵黃抗體的運輸和貯藏帶來了方便。
3.6 從免疫雞卵黃中提取特異性IgY抗體,是一種預防和治療動物和人類某些疾病的優質便利的好途徑,在生物製品的開發和綜合利用方麵有廣闊的前景,隨著對IgY製備和純化方法的不斷改進以及研究的不斷深入其應用將進一步擴大。 
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